Tạo cây thuốc lá mang gen đa đoạn kháng virus TMV, CMV, TYLCV và TSWV bằng kỹ thuật RNAi
Main Article Content
Abstract
Tóm tắt: RNAi là phương pháp sử dụng rộng rãi để phát triển các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus phổ rộng giúp giảm đáng kể thiệt hại về năng suất do virus gây ra. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành thiết kế vector chuyển gen nhị thể pGWTCYS mang cấu trúc RNAi lặp lại đoạn gen TCYS đảo chiều có ngăn cách một đoạn intron. Đoạn gen TCYS mang đa đoạn gen chức năng không đầy đủ của 4 loại virus gây hại phổ biến nhất trên cây thuốc lá ở Việt Nam là TMV (Tobacco mosaic virus – virus khảm thuốc lá), CMV (Cucumber mosaic virus – virus khảm dưa chuột), TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus – virus xoăn vàng lá cà chua) và TSWV (Tomato spotted wilt virus – virus héo đốm cà chua). Cấu trúc này được chuyển vào 2 giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và C9-1. Sau quá trình tái sinh và chọn lọc đã thu được 66 dòng cây (36 dòng K326 và 30 dòng C9-1) phát triển bình thường. Phân tích PCR cho thấy tất cả các dòng này đều dương tính với gen chuyển TCYS. Đánh giá tính kháng cả 4 loại virus nghiên cứu của các dòng thuốc lá chuyển gen này ở thế hệ T0 thu được 20/66 dòng (trong đó, 11 dòng K326 và 9 dòng C9-1) không có biểu hiện bệnh do những virus này gây ra sau lây nhiễm .
Từ khóa: TMV, CMV, TYLCV, TSWV, thuốc lá, RNAi
References
[1] Vũ Triệu Mân, Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật, NXB Nông Nghiệp, 2007.
[2] Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB, Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA, Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998) 13959-13964.
[3] Di Nicola Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V. Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus, Transgenic Res 14 (2005) 989-994.
[4] Lennefors BL, Savenkov EI, Bensefelt J, Wremerth-Weich E, van Roggen P, Tuvesson S, Valkonen JPT and Gielen J. dsRNA-mediated resistance to Beet necrotic yellow vein virus infections in sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris), Mol Breed 18 (2006) 313-325.
[5] Abhary MK, Anfoka GH, Nakhla MK, Maxwell DP, Post-transcriptional gene silencing in controlling viruses of the Tomato yellow leaf curl virus complex, Arch Virol 151 (2006) 2349-2363.
[6] Hamilton JH, Baulcombe DC, A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants, Science 286 (1999) 950-952.
[7] Baulcombe D, RNA silencing, Trends Biochem Sci 30 (2005) 290-293.
[8] Helliwell CA, Waterhouse PM, Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants, Methods 30 (2003) 289-295.
[9] Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM, Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs, Nature 407 (2000) 319-320.
[10] Goelet P, Lomonossoff GP, Butler PJ, Akam ME, Gait MJ, Karn J, Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA, Proc Natl Acad Sci USA 79 (19) (1982) 5818-5822.
[11] Callaway A, Giesman-Cookmeyer D, Gillok ET, Sit TL, Lommel SA, The multifunctional capsid proteins of plant RNA virus, Annu Rev Phytopathol 39 (2001) 419-460.
[12] Edwardson JR, Christie RG, CRC Handbook of viruses infecting legumes. CRC press, Boca Raton, Fla, Cucumoviruses (1991) 293-319.
[13] Roossinck M, Cucumber mosaic virus, amodel for RNA virus evolution, Mol Plant Pathol 2 (2001) 59-63.
[14] Chappel TM, Beaudoin AL, Kennedy GG, Interacting virus abundance and transmission intensity underlie tomato spotted wilt virus incidence: an example weather-based model for cultivated tobacco, PLoS One 8(8) (2013) e73321.
[15] Srinivasan B, Riley D, Diffie S, Shrestha A, Culbreath A, Winter Weeds as Inoculum Sources of Tomato Spotted Wilt Virus and as Reservoirs for Its Vector, Frankliniella fusca (Thysanoptera:Thripidae) in Farmscapes of Georgia, Environ. Entomol. 43(2) (2014) 410-420.
[16] Píco B, Díez MJ, Nuez F, Viral diseaes causing the greastest economic losses to the tomato crop. “The Tomato yellow leaf curl virus”- a review, Sci Hortic 67 (1996) 151-196.
[17] Chowda RV, Colvin J, Muniyapa V, Seal S, Diversity and distribution of begomoviruses infecting tomato in India, Arch Virol 150 (2005) 845-867.
[18] Ha C, Coombs S, Revill P, Harding R, Vu M, Dale J, Molecular characterization of Begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World Geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation, J Gen Virol 89 (2008) 313-326.
[19] Idris AM, Brown JK, Evidence for interspecific-recombination for three monopartite begomoviral genomes assosiated with the tomato leaf curl disease from central Sudan, Arch Virol 150 (2005) 1003-1012.
[20] Kormelink R, de Haan P, Peters D, Goldbach R, Viral RNA synthesis in tomato spotted wilt virus-infected Nicotiana rustica plants, Journal of General Virology (73) (1992) 687-693.
[21] Takeda A, Sugiyama K, Nagano H, Mori M, Kaido M, Mise K, Tsuda S, Okuno T, Identification of a novel RNA suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus, FEBS Letters 532 (2002) 75-79.
[22] Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus bằng kỹ thuật RNAi. Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen và Quản lý an toàn sinh học. Hà Nội, 28/08/2009, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ (2009) 19-28.
[23] Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm, Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2) (2009) 241-249.
[24] Nguyễn Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình, Tạo dòng cà chua PT18 kháng bệnh xoăn vàng lá do virus bằng kỹ thuật RNAi, Tạp chí Công nghệ sinh học 9(3) (2011) 333-340.
[25] Karimi M, Inzé D, Depicker A, GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation, Trends Plant Sci 7(2002) 193-195.
[26] Topping JF, Tobacco transformation. In Foster GD, Taylor SC (ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance, vol. 81. Humana Press, Totowa, NJ (1998) 365-485.
[27] Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, Sonnowald U, Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase: possible hexose sensing in the secretory pathway, Plant Cell 8 (1996) 793-803.
[2] Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB, Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA, Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998) 13959-13964.
[3] Di Nicola Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V. Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus, Transgenic Res 14 (2005) 989-994.
[4] Lennefors BL, Savenkov EI, Bensefelt J, Wremerth-Weich E, van Roggen P, Tuvesson S, Valkonen JPT and Gielen J. dsRNA-mediated resistance to Beet necrotic yellow vein virus infections in sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris), Mol Breed 18 (2006) 313-325.
[5] Abhary MK, Anfoka GH, Nakhla MK, Maxwell DP, Post-transcriptional gene silencing in controlling viruses of the Tomato yellow leaf curl virus complex, Arch Virol 151 (2006) 2349-2363.
[6] Hamilton JH, Baulcombe DC, A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants, Science 286 (1999) 950-952.
[7] Baulcombe D, RNA silencing, Trends Biochem Sci 30 (2005) 290-293.
[8] Helliwell CA, Waterhouse PM, Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants, Methods 30 (2003) 289-295.
[9] Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM, Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs, Nature 407 (2000) 319-320.
[10] Goelet P, Lomonossoff GP, Butler PJ, Akam ME, Gait MJ, Karn J, Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA, Proc Natl Acad Sci USA 79 (19) (1982) 5818-5822.
[11] Callaway A, Giesman-Cookmeyer D, Gillok ET, Sit TL, Lommel SA, The multifunctional capsid proteins of plant RNA virus, Annu Rev Phytopathol 39 (2001) 419-460.
[12] Edwardson JR, Christie RG, CRC Handbook of viruses infecting legumes. CRC press, Boca Raton, Fla, Cucumoviruses (1991) 293-319.
[13] Roossinck M, Cucumber mosaic virus, amodel for RNA virus evolution, Mol Plant Pathol 2 (2001) 59-63.
[14] Chappel TM, Beaudoin AL, Kennedy GG, Interacting virus abundance and transmission intensity underlie tomato spotted wilt virus incidence: an example weather-based model for cultivated tobacco, PLoS One 8(8) (2013) e73321.
[15] Srinivasan B, Riley D, Diffie S, Shrestha A, Culbreath A, Winter Weeds as Inoculum Sources of Tomato Spotted Wilt Virus and as Reservoirs for Its Vector, Frankliniella fusca (Thysanoptera:Thripidae) in Farmscapes of Georgia, Environ. Entomol. 43(2) (2014) 410-420.
[16] Píco B, Díez MJ, Nuez F, Viral diseaes causing the greastest economic losses to the tomato crop. “The Tomato yellow leaf curl virus”- a review, Sci Hortic 67 (1996) 151-196.
[17] Chowda RV, Colvin J, Muniyapa V, Seal S, Diversity and distribution of begomoviruses infecting tomato in India, Arch Virol 150 (2005) 845-867.
[18] Ha C, Coombs S, Revill P, Harding R, Vu M, Dale J, Molecular characterization of Begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World Geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation, J Gen Virol 89 (2008) 313-326.
[19] Idris AM, Brown JK, Evidence for interspecific-recombination for three monopartite begomoviral genomes assosiated with the tomato leaf curl disease from central Sudan, Arch Virol 150 (2005) 1003-1012.
[20] Kormelink R, de Haan P, Peters D, Goldbach R, Viral RNA synthesis in tomato spotted wilt virus-infected Nicotiana rustica plants, Journal of General Virology (73) (1992) 687-693.
[21] Takeda A, Sugiyama K, Nagano H, Mori M, Kaido M, Mise K, Tsuda S, Okuno T, Identification of a novel RNA suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus, FEBS Letters 532 (2002) 75-79.
[22] Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus bằng kỹ thuật RNAi. Hội nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen và Quản lý an toàn sinh học. Hà Nội, 28/08/2009, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ (2009) 19-28.
[23] Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm, Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2) (2009) 241-249.
[24] Nguyễn Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình, Tạo dòng cà chua PT18 kháng bệnh xoăn vàng lá do virus bằng kỹ thuật RNAi, Tạp chí Công nghệ sinh học 9(3) (2011) 333-340.
[25] Karimi M, Inzé D, Depicker A, GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation, Trends Plant Sci 7(2002) 193-195.
[26] Topping JF, Tobacco transformation. In Foster GD, Taylor SC (ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance, vol. 81. Humana Press, Totowa, NJ (1998) 365-485.
[27] Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, Sonnowald U, Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase: possible hexose sensing in the secretory pathway, Plant Cell 8 (1996) 793-803.